【sanger测序原理】Sanger测序，又称链终止法，是DNA测序的早期方法之一，由弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）于1977年提出。该方法通过化学手段在特定位置终止DNA链的延伸，从而确定DNA序列。Sanger测序因其准确性高、操作相对简单，在基因组研究和分子生物学中曾广泛应用。
一、Sanger测序原理概述
Sanger测序基于DNA聚合酶的特性，利用双脱氧核苷酸（ddNTP）作为链终止剂。在反应体系中，加入四种不同的ddNTP（ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP），当DNA聚合酶在合成过程中遇到这些物质时，会终止链的延伸。通过电泳分离不同长度的DNA片段，根据片段大小可推断出原始DNA的碱基序列。
二、Sanger测序步骤总结
| 步骤 | 内容说明 |
| 1. 模板准备 | 提取目标DNA作为模板，通常为单链或双链DNA片段。 |
| 2. 引物结合 | 加入与模板互补的引物，引导DNA聚合酶进行复制。 |
| 3. 反应混合 | 在反应体系中加入：DNA聚合酶、dNTPs、四种ddNTP（各一种）、缓冲液等。 |
| 4. 链延伸 | DNA聚合酶沿模板链合成互补链，遇到ddNTP时链终止。 |
| 5. 电泳分离 | 将四个独立的反应产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，按长度分离。 |
| 6. 序列分析 | 根据电泳结果，从最短到最长依次读取碱基，得到DNA序列。 |
三、Sanger测序的特点
| 特点 | 描述 |
| 准确性高 | 重复性好，错误率低，适合小片段测序。 |
| 操作简便 | 技术成熟，实验条件要求不高。 |
| 成本较低 | 相比新一代测序技术，成本更经济。 |
| 通量低 | 每次只能测一个片段，不适合大规模测序。 |
| 依赖电泳 | 需要手动或半自动电泳设备，效率有限。 |
四、Sanger测序的应用领域
- 基因突变检测
- PCR产物验证
- 克隆DNA序列确认
- 小规模基因组研究
五、Sanger测序的局限性
- 通量低：一次只能测定一个DNA片段，无法满足高通量需求。
- 成本较高：对于大规模项目，费用难以承受。
- 技术限制：对长片段或复杂区域测序效果不佳。
六、结语
尽管随着高通量测序技术的发展，Sanger测序逐渐被下一代测序（NGS）所取代，但在某些特定应用场景中，如小片段验证、临床诊断等领域，其仍具有不可替代的优势。了解Sanger测序的基本原理，有助于理解现代DNA测序技术的发展脉络。
